【一区家族】亚麻UGT家族全基因组鉴定及LuUGT175调控木质素生物合成的功能验证

一、文章基本信息

发表时间 ：2022年10月4日

第一单位 ：南通大学生命科学学院（江苏南通）

通讯作者 ：孙健（ sunjian8416@163.com ）、苏建光（ jianguangsu@163.com ）

文章题目 ：Comprehensive analysis of the UDP‑glycosyltransferase gene family in flax [ Linum usitatissimum L.] and functional verification of the role of LuUGT175 in the regulation of lignin biosynthesis

发表期刊 ：Industrial Crops & Products

DOI：

二、摘要

背景：亚麻是全球重要的纤维作物，但纤维中木质素含量高会导致质地硬脆、可纺性差。UDP-糖基转移酶（UGTs）参与植物次生代谢，其糖基化修饰可影响木质素单体转运与聚合。

方法：本研究利用保守PSPG基序在亚麻基因组中鉴定出190个UGT基因（LuUGTs），进行系统进化、基因结构、表达模式分析；并通过CRISPR/Cas9敲除、组织化学染色、双荧光素酶报告系统等手段验证LuUGT175的功能。

结果：LuUGTs分为16个进化组，扩增主要依赖全基因组/片段重复；LuUGT175在茎与纤维中高表达，敲除后植株矮化、茎木质部染色加深且纤维层出现异位木质化；LuNAC61被鉴定为其上游负调控转录因子，可直接结合LuUGT175启动子。

结论：LuUGT175通过糖基化调控木质素单体稳态，进而影响亚麻细胞壁木质化，为低木质素、高品质亚麻分子育种提供理论依据和基因资源。

三、主要内容

图1

段落内容 ：作者利用HMM与PSPG盒双重筛选，在亚麻全基因组中获得190条LuUGT候选序列。为展示其染色体分布格局，将168条定位于15条染色体，22条仍留在scaffold。图1A显示Chr3基因最密集（27个），Chr1最少（仅3个），呈现明显的不均衡分布；图1B给出22个scaffold-level基因的具体位置。该分布模式提示亚麻在进化中经历了大片段重复与染色体重排事件，为后续分析基因扩增机制提供线索。

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图例说明 ：图1A为15条染色体上LuUGT基因位置示意，染色体编号位于底部，每条染色体右侧标注基因编号；图1B列出22个位于scaffold的LuUGT编号及对应scaffold名称。

图2

段落内容 ：为解析LuUGT家族的进化关系，作者将190条亚麻UGT与19条拟南芥、3条玉米UGT共同构建邻接法系统树（bootstrap=1000）。结果将212条序列划分为17个亚组（A–Q），其中亚麻占据16组（Q组缺失）。最大的L组含29个成员，A、D、E、G组也都超过20个，合计占家族69.5%，说明这些分支在双子叶植物扩张最迅速。树形还显示LuUGT175与拟南芥AtUGT72B1处于同一E组小支，为后续功能研究提供直系同源依据。

图例说明 ：图2采用彩色扇形展示17个亚组，亚麻序列无图标，拟南芥标星，玉米标圆；分支长度代表氨基酸差异，bootstrap值>50%标注于节点。

图3

段落内容 ：利用MEME与CDD对190条LuUGT进行保守元件解析，发现所有成员均含 motif1（UDGT催化域），171条同时含motif1-3；基因结构方面，60条无内含子，其余1–14个内含子不等，外显子数2–3个最常见。图3将系统树、motif构成、结构域及外显子-内含子组织四图并联，可直观看出同一亚组内基因结构高度相似，不同组间则差异显著，支持系统分组可靠性，也为后续选择E组LuUGT175做功能研究提供结构依据。

图例说明 ：图3a为LuUGT进化树；b为motif1-3彩色方块图；c为NCBI-CDD预测结构域；d为外显子（绿色框）与内含子（灰线）排列，UTR以蓝色框表示。

图4

段落内容 ：通过TBtools共线性模块，作者在全基因组范围鉴定到21对全基因组重复（WGD）与25对片段重复，占家族扩增主体；图中红线连接重复对，彩色背景块显示染色体间共线区。该结果首次从基因组水平证实WGD与局部重复是LuUGT家族扩张的主要动力，也解释了为何多数基因呈簇状分布。结合Ks值（未图示），大部分重复事件与双子叶古代γ三倍化及亚麻特异全基因组复制吻合。

图例说明 ：图4以circos形式展示15条染色体，红线标出46个LuUGT重复对，染色体编号位于外圈，彩色条带表示共线区块。

图5

段落内容 ：为探讨LuUGT的跨物种进化，作者分别构建亚麻-拟南芥与亚麻-水稻共线性图。结果：23条LuUGT与18条AtUGT存在共线，而水稻仅3条LuUGT与3条OsUGT对应，显示该家族在双子叶间保守性远高于单子叶。图中灰色背景线为大片段共线区，红线突出UGT对，直观反映双子叶分化后UGT家族相对稳定，而单子叶与双子叶间剧烈分化，为选择拟南芥AtUGT72B1作为LuUGT175功能参照提供进化依据。

图例说明 ：图5左侧为亚麻与拟南芥共线性，右侧为亚麻与水稻；红线标出直系同源UGT对，灰色背景表示染色体共线区块，染色体号标注于两端。

图6

段落内容 ：基于NCBI-SRA公开RNA-seq数据，作者绘制190条LuUGT在根、茎、叶、花、纤维及种子5个发育阶段的表达热图。结果发现3条基因任何组织均不表达，83条呈组成型表达，64条表现组织特异；其中LuUGT175在茎与快速伸长期的纤维中FPKM最高，提示其可能参与纤维次生壁形成。Beanplot进一步展示表达分布，证实E组整体在茎部富集，为后续聚焦LuUGT175功能奠定表达证据。

图例说明 ：图6A为热图，颜色由蓝到红代表FPKM低-高；图6B为beanplot，横轴为组织，纵轴为log10(FPKM+1)，曲线密度反映表达分布。

图7

段落内容 ：CRISPR/Cas9敲除LuUGT175获得3个T0突变系（L4、L7、L8）。快速生长期（7周）茎徒手切片经Wiesner（盐酸-间苯三酚）与Mäule（高锰酸钾-盐酸-氨水）染色显示：野生型仅木质部呈淡紫红或棕色；突变体木质部颜色加深至暗紫红，且原本不染色的纤维层亦出现紫红/深棕，表明异位木质化。量化表明突变体茎 lignin 含量显著升高，证实LuUGT175缺失导致木质素过量积累。

图例说明 ：图7A-D为Wiesner染色，E-H为Mäule染色；标尺500 µm，F示纤维，X示木质部，突变体编号标注于图。

图8

段落内容 ：为更清晰展示纤维束与木质部差异，作者提供图7局部放大（100 µm）。放大图可见野生型纤维细胞壁几乎不着色，突变体纤维壁呈明显紫红（Wiesner）或深棕（Mäule），且细胞间隙变小；木质部导管壁厚度亦增加。该结果在细胞水平直接证明LuUGT175通过糖基化调控木质素单体转运，其功能缺失使木质素在纤维细胞异位聚合，降低纤维柔韧性。

图例说明 ：图8A-D、I-L为纤维束；E-H、M-P为木质部；左侧四行为Wiesner，右侧四行为Mäule；标尺100 µm，突变体系号标注于各图。

图9

段落内容 ：作者对E组26条LuUGT与184条LuNAC转录因子进行表达相关性计算，发现17个LuNAC与20条LuUGT呈强负相关（r ≤ −0.6）。其中LuNAC61与LuUGT175相关系数达−0.86，位居负相关首位，提示其可能为上游负调控子。热图以蓝-白-红梯度展示相关系数，可直观比较不同NAC与UGT组合间的正负关系，为筛选LuNAC61作为候选调控基因提供数据依据。

图例说明 ：图9为横向热图，纵列为LuNAC编号，横行为LuUGT编号，颜色标尺由蓝（负相关）经白（0）至红（正相关），星号标出LuNAC61-LuUGT175对应格。

图10

段落内容 ：基于共表达网络分析，LuUGT175与LuNAC61被聚于同一模块且边权重高，表明二者在转录水平存在显著关联。网络图以节点大小反映连接度，边线粗细代表共表达权重，LuNAC61处于模块核心位置，进一步支持其作为负调控枢纽。该结果与图9相关性分析互为印证，为后续酵母单杂、荧光素酶实验提供假设基础。

图例说明 ：图10为无向网络图，绿色节点代表UGT，橙色节点代表NAC；边线越粗表示共表达权重越大，LuNAC61与LuUGT175用红色高亮。

图11

段落内容 ：作者通过烟草瞬时表达证实LuUGT175-GFP融合蛋白定位于细胞质与细胞核，符合其作为糖基转移酶参与胞质糖基化及核内信号调控的双重角色。酵母单杂交显示LuNAC61能驱动报告基因在150 ng/ml AbA选择性培养基生长，而空载体对照不能，表明其可直接结合LuUGT175启动子。双荧光素酶实验进一步在植物体内验证：LuNAC61显著抑制LuUGT175启动子活性，荧光信号低于对照50%以上，综合证明LuNAC61为LuUGT175上游负调控因子。

图例说明 ：图11A为共聚焦GFP亚细胞定位，标尺50 µm；B为酵母单杂平板，左-右依次为负对照、正对照、实验组；C为烟草叶片荧光成像，上排为对照，下排为LuNAC61效应组，亮度差异直观展示抑制效果。

四、总结此文

基因组挖掘：以PSPG盒为标签，系统鉴定190个LuUGTs，分布于15条染色体，分属16个进化组（A–P），其中E组与拟南芥AtUGT72B1直系同源。

进化与复制：全基因组重复与片段重复是家族扩张主因；68.4%成员含内含子，保守基序1–3在蛋白C端构成糖基转移酶催化核心。

表达谱：RNA-seq显示187个LuUGTs在至少一组织中表达，83个组成型表达，64个呈组织特异；LuUGT175在茎与纤维优势高表达。

功能验证：CRISPR敲除LuUGT175获得3个T0突变系，植株矮化、茎木质部与纤维层出现异位木质化，Wiesner/Mäule染色显著加深，木质素含量升高。

调控机制：共表达与相关性分析筛选到负相关转录因子LuNAC61（r = −0.86）；酵母单杂、双荧光素酶实验证实LuNAC61可直接结合并抑制LuUGT175启动子活性。

意义：首次阐明亚麻UGT家族全貌，揭示LuUGT175-糖基化-木质素通路，为利用生物技术降低纤维木质素、改善可纺性提供关键靶点。

五、生成思维导图（文字版）

基因组鉴定

190 LuUGTs │ 分16组 │ 染色体不均分布 │ 全基因组/片段重复扩张

表达特征

187个表达 │ 83组成型 │ 64组织特异 │ LuUGT175茎/纤维高表达

功能验证

CRISPR敲除 → 矮化 │ 茎木质部染色加深 │ 纤维异位木质化 │ 木质素含量↑

调控网络

共表达筛选 │ LuNAC61负相关(r=−0.86) │ 酵母单杂+双荧光素酶验证直接结合

应用前景

低木质素分子育种 │ 改善纤维柔软度与可纺性 │ 减少脱胶污染